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大片断连接的几个问题_susanfly
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发布时间：2024-05-15
生物谷-中国生命科学论坛 核酸（PCR）区
1. 多大的insert 和 vector 算是比较难于连接的大片段？
2. 大片段连接时候的连接条件如何优化？例如单酶切末端连接。
大片段连接时候的比例是否要按照1 3左右，还是insert要大大过量（这两种观点我都听说过，而且各自都说对方的不合理！）
4. 大片段连接时候是否有最小量的要求，insert和vector的总量低于一定量就连接不上？
5. 是否有专门适合于大片段连接的ligase以及商业化的感受太细胞？
希望大家谈谈自己成功的经验！
Not exactly1 3,acording your lignase and time andyour ends. Blunt ends?fastlink ligase is differntfromT4
amount I used is less 100 ng totally, because of diffculty ofgetting big amount insert from T-vector.
the end are XhoI (in one lagation, both ends are XhoI) and SalI(another ligation, both ends are SalI).
these two projects failed several times at normal liagtioncondition. use Top10 cells from invitrogen.
chge的问题有点简单，
关于比例有个公式，可以理解为片段小的加大量（摩尔），而不论是载体还是基因片段。
你说的T载体的insert有大小的限制从哪里得来？
你的第4个问题我理解为实际摩尔量偏低引起，
至于感受态细胞我从来不当回事，以NEB说的最难连接的平粘，我用常规方法连接取5ul转化结果得到的克隆远远多于阳性对照（2ng)我的载体9.5K正。
chge，我以为自己作克隆算高高手了，不想这边有一做了几十次克隆的博士在，一交流发现自己不过是小巫见大巫。
可惜他不肯上网，少了一位好的专业网友。
[此贴子已经被作者于2002-12-2716 17 39编辑过]
chge的问题有点简单，
关于比例有个公式，可以理解为片段小的加大量（摩尔），而不论是载体还是基因片段。
你说的T载体的insert有大小的限制从哪里得来？
你的第4个问题我理解为实际摩尔量偏低引起，
至于感受态细胞我从来不当回事，以NEB说的最难连接的平粘，我用常规方法连接取5ul转化结果得到的克隆远远多于阳性对照（2ng)我的载体9.5K正。
chge，我以为自己作克隆算高高手了，不想这边有一做了几十次克隆的博士在，一交流发现自己不过是小巫见大巫。
可惜他不肯上网，少了一位好的专业网友。
你说的计算比例公式是什么,是摩尔比1 3么,还是有专门用于大片断连接的校正公式?
我的INSERT 和T载体得大小很接近,胶回收时候一不小心就会把T载体带进来一点,那就全完了.用过第2个酶切T载体以后再分离或者不分离灭活直接连接的做法,也没有成功.直接分离的话,因为不能用大上样量,所以得率不高.
前面的载体构建还算顺利, 我现在的问题肯定是在连接过程以及条件优化上了.
我现在怀疑可能是连接时候INSERT 和 VECTOR得总量偏低所致,特此求教诸位,
多大量为最佳,以及两者比例. 还希望大家多提建议. 我真是头痛啊..
克隆我也做过不少了,呵呵, 现在遇到这么多问题, 才发现其实所会的只不过是一些皮毛而已.
[此贴子已经被作者于2002-12-281 41 11编辑过]
难道你只有一种T载体吗？3.6K OR 4.3K？想办法跑琼脂糖电泳把它们分分开，回收是必要的，否则你如何检测阳性克隆？
2种载体有抗性的区别？
如果你说4K加10K算大片段连接，那么也不至于太难做。
\"我的INSERT 和T载体得大小很接近,胶回收时候一不小心就会把T载体带进来一点,那就全完了.用过第2个酶切T载体以后再分离或者不分离灭活直接连接的做法,也没有成功.直接分离的话,因为不能用大上样量,所以得率不高.\"
chge,真不幸，又一次看到你的类似的帖子！不过这在分子生物学研究中常有的事情，我也遇到过。
我前一端时间构建了一个载体跟你的过程有点相同
我首先从人基因组DNA中PCR得到5Kb片段A，然后连接到TOP载体中，在用SalI从A-TOP载体中酶切得到A，将A连接到用XboI（与SalI同尾）酶切的载体（21kb）中，这个过程正常的话1-2个星期就可以完成，到我做了3个月后才经人指点连接成功。
我开始采用的方法是从A-TOP中用SalI酶切后，胶回收INSERT A，而21kb载体则酶切后热
变性（65C）后直接连接，做了近3个月一直不成功，当时郁闷之极
后来实验室的高手说胶回收时可能对酶切末端有损伤，他建议我采用选非INSERT中的酶酶切载体的方法处理A-TOP，21kb载体处理方法不变，结果阳性率为10-20%
之后我另外还构建了3个类似的载体，只是跟复杂一点，也是采用这种方法，很成功！
我看你也用过这种方法，但不知你为什么不成功
你的第2个载体是如何处理？
我想你可以首先要确保INSERT和载体的酶切完全，使用酶切载体方法时酶的选择一定是INSERT中不存在的
另外为何从T-VECTOR中得到的INSERT少呢，如果你加大INSERT-T-VECTORDNA的量不就能提高INSERT的量吗？
我这次的情况着实挠头，已经折腾我有半个月了，几乎各种常规的方式都做到了。
我是基因组PCR产物，原来以为直接可以克隆进入目的载体，所以也没有特别介意
PCR产物长度问题。后来，PCR产物直接连没成功（一共6个全都没有成功），所以改为
T载体（3923bp）可克隆的方式，前面几个都还可以，虽然有点曲折，但是都成了，两个目的载体一个是A =5826bp(vector)+2.7kb; B= 5.9kb+ 500bp+ 2.5kb; 现在要在A上加 C= 4.3kb(XhoI/XhoI),B上加 C= 3.6kb(SalI/SalI); 因为T载体和insert的长度很接近，开始用NarI orNaeI没切T载体，结果好像没切不好，得到的重组质粒都是原来的T载体连接产物。我用PCR 筛选。
第2轮采用直接分离的方法，跑胶达到6小时，总算分开了，其实还留了点，结果还是不行。
第3轮采用PvuI没切T载体，胶纯化，没有阳性克隆（有几个假阳性）；
然后采用1。SalI没切； 2. SalI/PvuI, 胶纯化； 3.. SalI/PvuI,直接灭活，然后连接，基本上还是失败。其中3 给出很多B的PCR阳性结果，然后用目的载体的PCR晒出2个，miniprep以后，没切鉴定发现是目的载体自连。
以上的各轮中假阳性结果中大多是T载体与insert的连接，要么是空的目的载体。 两个载体构件都在最后一步。
如果用单没切，例如SalI,胶回收时候，不能打上样量，所以得率不多。
如果用SalI/PvuI or XhoI/PvuI的话，还有可能。 目前正在大量积累载体和insert.
还有一个怪现象，我的insert实在T载体上的，细菌30%甘油-80冻存，直接用它长菌没有得到质粒，划盘后，挑克隆也没有，好在还有点质粒，直接转化后，跳克隆得到质粒了，但是用这个菌液直接再长，又没有质粒了，同时做的其他细菌扩增一点没有问题。
不知道是何原因，就这事，也耽误我好几天！
开始的时候，出现
难道你只有一种T载体吗？3.6K nbsp;OR nbsp;4.3K？想办法跑琼脂糖电泳把它们分分开，回收是必要的，否则你如何检测阳性克隆？
2种载体有抗性的区别？
如果你说4K加10K算大片段连接，那么也不至于太难做。
碰到问题难以解决或者身边没人，那么作为一个高素质的科研人员首先做的就是打破常规去尝试。我曾经看过一篇转化效率机制的文章。发给你参考？
i，你真是大救星啊，
一言提醒梦中人啊，我可以把insert再克隆到一个大小不一样的质粒中去是一试，就绝对不会有载体残留问题了。
回答你的问题： ２个载体抗性一样。amp的。
你说的公式可否发给我？我研究一下。 文章也可以发过来，如果方便的话。 chge@yahoo.com
多谢。
今天的结果是，用pvuI/XhoI酶切T载体+insert然后胶纯化作连接，设置了一个insert单独的对照，结果满盘都是！！
说明PvuI酶切不完全。
以外行身份参加讨论，希望各位别介意，我尚未做过一个克隆，下个月才做类似的反应，所以很感兴趣。个人理解：
连接反应是可以用以下公式表达的：
A+B=C
是双分子一级反应，且是平衡反应，平衡常数应小于1。欲提高c的产量，提高反应物A和B的浓度都可以，也可同时提高A和B的浓度来提高分子碰撞的机会进而提高产量。
有时我们有充足的A比如insert，或希望B能充分反应完，比如不希望有较多的空载体，则可以提高A的反应浓度，多少合适？设平衡常数为0.8（我假想的，没查），要使90%的B都参加反应，则用公式0.8=0.9/(0.1乘n)则n=11.25
有时我们有较好筛选C 的方法（搞性），则比例就不太重要而浓度重要。对于较小DNA的浓度在molecularcloning3上看到可用增稠剂：PEG处理。
今天的结果是，用pvuI/XhoI酶切T载体+insert然后胶纯化作连接，设置了一个insert单独的对照，结果满盘都是！！
说明PvuI酶切不完全。
我有个问题，为什么酶切载体时要等到转化后才能确定酶切是否完全，难道酶切后不能用琼脂糖电泳鉴定酶切是否完全吗？
还有一个问题，你选择酶切载体的酶，是在多克隆位点还是在以外的位置？最好是可以将载体部分拦腰砍断，至少要可以使酶切后的载体能与insert明显分开
i 的建议很有价值，可以试一试
很同意 i 的观点：作为一个高素质的科研人员首先做的就是打破常规去尝试
我做的就是如此。 其中一个为例，insert是3.6kb， T载体是3.9kb,在胶上稍微短一点是看不出来差别的。
我用得pvuI把T载体拦腰切断为大概1 和 2 kb左右（具体记不住了），还有NarI or NaeI都可以。
我用SalI/PvuI没切以后，为3个片段，最大的位我要的insert,但是如果其中含有微量的T载体的画，我是不可能知道的。
我的没切是20-40小时的，至少加了2次pvuI.
所以我现在目前面临的困境是：连接效果不好，可能是T载体+insert连接，也可能是连接物总量过小，都和insert纯化有关，或者合并有其他的原因。
所以i的话提醒我，我可以克隆insert到其他的与我目的insert大小差别比较大的载体里，然后在没切纯化，虽然耗时费力，但是也没有更好的办法了。
对了，谁知道那些载体比较小或者比较大？要一般性的，我对这些倒不是很清楚的。
作为打破常规，也不一定全对的，各有优缺点吧。每个人都有自己的观点，我上面说的两个人对连接比例的观点是截然相反的，两个人一个是日本博士，一个是美国博士，都用自己的方法成功地做出来过。
还有胶分离时的浓度，也有两种观点，一种说低浓度（0.6%), 一种说高浓度（甚至1.5%）.我实际使用的是高浓度1.2%。
3.6与3.9在0.8％左右的胶上勉强可以分开。为分开方便建议使用好胶如sigma，另加样时浓度调低一点，梳子用较窄的但可以用透明胶布搞宽点，胶做厚一点。这样跑出来条带容易分开并通过加样量的提高获得的片断数量。
你说你的T＋I质粒保菌后容易丢失，是不是你的片断比较特别，容易受到菌体的排斥。而在你的第二个载体里排斥更加厉害，以至于很难得到克隆。
谢谢dianhe的提醒，我会考虑这个问题。由i的建议引申开，我有了新的想法，既然我的问题（最起码是目前面临的问题）是insert从T载体上的纯化问题，我可以用NaeI切去T载体上1KB多片段（673- 1948）,其中f1 origin 和kan抗性基因丢失，没有破坏Amp基因，然后自连，做成一个小一点的质粒，那么，只剩下2.7k的T载体 和 3.6k or 4.3k的insert就可以容易分开了。应该如此，正在试。
还有一个方法，先PvuI酶切，胶纯化（此步必要），然后再用目的酶切，可以解决没切不完全的问题，这也是才想出来的方法，但是不如上面的容易得到大量insert。
我虽然没有用roche or sigma的agarose,应该质量没有太大的问题。我现在的问题不是分不开，而是如果要分开，上样量就不高；得不到大量的insert;如果用内切酶切T载体的话，又有可能切不完全，导致连接时候非特异连接增高（事实已经证明极高）。所以现在的面临的首要问题是排除干扰得到大量纯化的insert。
今天又遇到的问题是，用NaeI酶切过夜切，乱套了。上午重新买的酶，下午切了4小时，
仍然切不完全（对照XhoI已经切光了）。一查，NaeI对甲基化敏感。一方面加大酶量继续过夜（我的模板量不高，其实理论上有一个copy就够了）。另一方面用T+insert质粒从新用inv110感受态细胞制备质粒。
我的问题是：这种情况下，我加大酶量能否得到较好的酶切效果？因为用inv110细胞我还得多费2天时间。真是一个问题接着一个问题，都是意料不到的，感觉像是跑题了，唉！
我看你现在的关键问题不在于连接的浓度和比例,而是获得分离彻底的外源.
如果t vector的大小实在不合适,试一试自攒t/a载体.
平端酶(EcoR V) 切质粒(如 pBlueScript SK-) ,酚 氯仿纯化回收.
然后利用taq 将dttp加在平端上形成t tail,再酚 氯仿纯化回收.
详细如下,yog介绍的
1. Digest 1 μg of plasmid (such as pBlueScript SK-) with ablunt-end restriction enzyme (such as EcoR V) asfollows
1 μg of DNA in 40 μl of ddH2O
5 μl of 10X EcoRV Restriction Digest Buffer
0.5 μl of EcoRV Restriction Enzyme
Adjust the final volume to μl with ddH2O
Incubate at 37°C for 2 hours
2. Add 100 μl ofPhenol Chloroform Isoamyl Alcoholto the reaction mixture.
3. Centrifuge in a microcentrifuge at maximum speed for 10 min toseparate the phases.
4. Transfer the aqueous phase (upper phase) to a cleanmicrocentrifuge tube.
5. Add 100 μl of ice-cold 100% Ethanol and centrifuge in amicrocentrifuge at maximum speed for 10 min to pellet theDNA.
6. Discard the supernatant, invert the microcentrifuge tube overpaper towels, and allow the pellet to air dry.
7. Add 20 μl of 1X Taq Polymerase Buffer and mix until the pelletis completely dissolved.
8. Add 0.5 μl of 100 mM dTTP (final concentration 2 mM).
9. Add 1 Unit of Taq Polymerase per μg of DNA in the reaction, thenadjust to a final volume of 25 μl using ddH2O.
10. Incubate the reaction at 72°C for 2 hr.
11. Add 50 μl ofPhenol Chloroform Isoamyl Alcoholto the reaction mixture and mix well.
12. Centrifuge in a microcentrifuge at maximum speed for 10 min toseparate the phases.
13. Transfer the aqueous phase (upper phase) to a freshmicrocentrifuge tube.
14. Add 50 μl of Chloroform and mix well.
15. Centrifuge in a microcentrifuge at maximum speed for 10 min toseparate the phases.
16. Transfer the aqueous phase (upper phase) to a freshmicrocentrifuge tube.
17. Add 100 μl of ice-cold Ethanol and mix well.
18. Centrifuge in a microcentrifuge at maximum speed for 10 min topellet the DNA.
19. Discard the supernatant, add 100 μl of ice-cold 70% Ethanol,and mix well.
20. Centrifuge in a microcentrifuge at maximum speed to pellet theDNA.
21. Discard the supernatant and wash the DNA with 70% Ethanolagain.
22. Invert the microcentrifuge tubes over paper towels and allowthe DNA pellet to air dry for a couple of minutes.
23. Dissolve the DNA pellet in 1X TE.
24. For ligation reactions, use approximately 25 to 50 ng ofT-Vector
ROCHE的MS agarose可以分辨4个BP的差异片段，跑起电泳来和一般的不是一样吗，怎么会上样量少呢
to yog 因为两个片段相差不大，所以上样量必须降低浓度，用很长的样品槽，得到的回收，溶解在２５ul水中的浓度不超过２０ng/ul,
现在是过节，不说买东西要时间，就是用了也有可能还有问题。我上面讲了，能分开，但是有可能混有一点t载体的话，就麻烦了。
所以完全可能还有其他的原因导致连接转化失败，但是目前首先需要得到的是大量醇化的足够的insert.然后才能考虑别的因素，flame7799的方法，我想现在作的差不多吧，已经是等于在构件新的t载体了。如果成功的话，新的T载体大小为2.7kb,其中没有f1origin以及kan抗性基因。
这是一个胶分离例子,今天刚做的,还没有RUN完,中间监测. 1,2LANE是一种样品,3,4是另外一个样品.都是用NaeI切的.
显然,第3 LANE的样品比LANE 4 的要清晰的多. 但是这样的样品回收太低, 在其他的胶回收中存在就是这个同样的问题.MARKER是几十ng级别的.
这个不是我要分离的INSERT. 是重新构建T载体,用NaeI切,最高的两个片断大小相差1.3KB.
我上传的这个图片,分离我需要的东西,应该是足够的了,我只要1个拷贝就可以.
此主题相关图片如下：
我多数时候还是用笨方法，就这么切下来连，不管有没有混杂
最后多筛克隆， 基本上可以得到我想要的片段，你这样不行，只能怪你运气不好啦
我多数时候还是用笨方法，就这么切下来连，不管有没有混杂
最后多筛克隆， 基本上可以得到我想要的片段，你这样不行，只能怪你运气不好啦
我是多insert科隆，前面几个都是和你说的一样做的，有时候阳性克隆可达到60以上，又一次90%。现在是第3个片段插入，两个课题的两个载体都是同样现象，估计是有同样的问题。现在只有先得到大量纯化insert片段再说了。我的T载体已经测过序列，如果重新用其他的载体做的话，又要耽误1周时间了。
只能说运气不好。其实还不一定是现在怀疑的这个问题呢，那样的话，更糟糕。
你是什么意思啊？是整个T载体和PCR产物的连接么？
不是很好。我用得是invitrogen(就是原来的Gibco)的pCR2.1 TA克隆试剂盒，
蓝白筛选，兰斑效率低于50%。 不过总算还有阳性克隆。
我目前的T载体切除片段再连接还没有做完呢，不知道行不行，上帝保佑了。
我开始的时候是用PCR产物直接连接的啊，没有成功。6个，一个也不行。实在没有办法，才改用得TA克隆的方法的。
呵呵，这个图是今天分离NaeI没切T+insert得电泳，现在还有一个问题是NaeI对甲基化敏感，所以NaeI过量没切也不好，可能上面的结果要失败（上面的结果理论上只有两条带）。所以我昨天已经从新用质粒用inv110细胞转化非甲基化的质粒，今天各挑了3个菌落长去了，这样如果这个结果失败的话，用新质粒等于没有耽误时间（其实已经耽误不少了）。
连接的量的问题也是个问题，纯化量少，浓度低。如果要保持比例，一般最高90ng insert(4.3kb)， vector=? 9kb.如果不考虑比例，也高不了多少，我用Roche rapid kit or Takara kit 2,连接体系一般不超过10ul（takara）or 21ul(roche),所以总连接体积也不高10ul，连接产物全用上，一般挑30-40克隆，没有阳性或者假阳性。
每一次的没切纯化效果都不一样，如果多次纯化合并，又一次混入T载体，就全玩了。所以还是目前的法子可靠些。
chge，我看了你的电泳图，我觉得够亮了嘛，我以前回收过比你着还少的，一样可以连上。我用的是glassmilk回收，我觉得它回收效率很高。
我是个新手，还望大家多多执教；总的感觉，像这种大片段克隆是有一定难度。有两个问题：
（1）周围经验表明似乎对于10kb以上的连接产物用电转化效果最好；而宿主菌用DH10B或XL blue为佳
（2）如果纯化的片断浓度低的话，可以沉淀，但需要加glycogen（Invitrogen），这样可保证微量的DNA不至于因沉淀丢失掉。
学习chge大侠的精神！
呵呵，这个图是个样子，我只是想说明一下上样量和纯化效果的关系，不是真正要做的那个具体的克隆，是要作克隆的insert和T载体的重新质粒构建。
就上面的分离纯化后（中间的片断），溶解到25ul水里，然后取1ul作连接和转化，因为我要的就是自身连接，就是一般的对照吧，而且没有脱磷，怕菌落太多，所以没多用。结果每个盘上仅有几个菌落，都是如此。结果很奇怪的，不过估计可能和NaeI对甲基化敏感有关。但是第5 lane的结果是用sphI酶切的，结果也不多，倒是奇怪。死马当活马医吧。明天看看能不能长出来。
还有我遇到一件怪事，我同样的转化结果在Carb plate 上有，在Amp plate上就一个没有，同时铺盘。
有没有用过那个那个 是叫旋转蒸发仪吧， 我也记不清了
可以浓缩DNA的，那样的损失会很小的
chge
是呀,上次我路过陈家山也看见了旋转蒸发仪这个东西,效果不错,不如我介绍你也去定一台吧!
说实在的,其实抽真空干燥一下也行.
另外,我认为应该把得到阳性重组子的连接反应看成是两步反应,首先是外源和载体的一端连接,然后是重组的线性载体的两端自连形成环化的重组质粒.
连接体系里insert和vector的浓度有一个最佳值,既要保证第1步反应形成较多的重组型线性载体,又要保证第2步反应时,重组型线性载体的自连不受到未反应完的单体片断的干扰.也就是过高过低都不好.
一般,insert要高于vector,目的是让vector在第一步反应中尽量消耗光,不要形成自连空载体.但是,insert过高时也会干扰第二步incert-vector重组子的自连.这在小片断连接时不太明显.因为,小片断连接时,线性incert-vector重组子的自连比较容易.而当进行大片段连接时,这一步很难完成,就好比你拿着一个1米长的勺子吃饭,困难极了.
insert和vector的比例实际上并不是很重要,一般情况下,我们用的外源和载体长度不会相差十倍,3 1就可以满足大多数的要求.要注意到实际上是小片断连接时外源加的一般比较多.
给一个极限的例子;建BAC库时,外源200Kb,载体7.5Kb,通常连接时外源 载体为1 10,注意,这时是载体绝对过量.
连接是很痛苦的,但也很值得我们去思考.还有一些想法不成熟,以后再谈吧!
yog
我没建过bac库,国内建bac库的人可能加起来也不到十个.不过,国外的protocol上大多数都是这个比例.我认为你说的也有道理.估计这个比例也是来自理论和实践的停战协议书.
文本版本 大片段连接的几个问题
作者：chge 2002-12-278 18 00)大片段连接的几个问题1. 多大的insert 和 vector 算是比较难于连接的大片段？
2. 大片段连接时候的连接条件如何优化？例如单酶切末端连接。
大片段连接时候的比例是否要按照1 3左右，还是insert要大大过量（这两种观点我都听说过，而且各自都说对方的不合理！）
4. 大片段连接时候是否有最小量的要求，insert和vector的总量低于一定量就连接不上？
5. 是否有专门适合于大片段连接的ligase以及商业化的感受太细胞？
希望大家谈谈自己成功的经验！
Not exactly1 3,acording your lignase and time andyour ends. Blunt ends?fastlink ligase is differntfromT4
amount I used is less 100 ng totally, because of diffculty ofgetting big amount insert from T-vector.
the end are XhoI (in one lagation, both ends are XhoI) and SalI(another ligation, both ends are SalI).
these two projects failed several times at normal liagtioncondition. use Top10 cells from invitrogen.
chge的问题有点简单，
关于比例有个公式，可以理解为片段小的加大量（摩尔），而不论是载体还是基因片段。
你说的T载体的insert有大小的限制从哪里得来？
你的第4个问题我理解为实际摩尔量偏低引起，
至于感受态细胞我从来不当回事，以NEB说的最难连接的平粘，我用常规方法连接取5ul转化结果得到的克隆远远多于阳性对照（2ng)我的载体9.5K正。
chge，我以为自己作克隆算高高手了，不想这边有一做了几十次克隆的博士在，一交流发现自己不过是小巫见大巫。
可惜他不肯上网，少了一位好的专业网友。
[此贴子已经被作者于2002-12-2716 17 39编辑过]
chge的问题有点简单，
关于比例有个公式，可以理解为片段小的加大量（摩尔），而不论是载体还是基因片段。
你说的T载体的insert有大小的限制从哪里得来？
你的第4个问题我理解为实际摩尔量偏低引起，
至于感受态细胞我从来不当回事，以NEB说的最难连接的平粘，我用常规方法连接取5ul转化结果得到的克隆远远多于阳性对照（2ng)我的载体9.5K正。
chge，我以为自己作克隆算高高手了，不想这边有一做了几十次克隆的博士在，一交流发现自己不过是小巫见大巫。
可惜他不肯上网，少了一位好的专业网友。
你说的计算比例公式是什么,是摩尔比1 3么,还是有专门用于大片断连接的校正公式?
我的INSERT 和T载体得大小很接近,胶回收时候一不小心就会把T载体带进来一点,那就全完了.用过第2个酶切T载体以后再分离或者不分离灭活直接连接的做法,也没有成功.直接分离的话,因为不能用大上样量,所以得率不高.
前面的载体构建还算顺利, 我现在的问题肯定是在连接过程以及条件优化上了.
我现在怀疑可能是连接时候INSERT 和 VECTOR得总量偏低所致,特此求教诸位,
多大量为最佳,以及两者比例. 还希望大家多提建议. 我真是头痛啊..
克隆我也做过不少了,呵呵, 现在遇到这么多问题, 才发现其实所会的只不过是一些皮毛而已.
[此贴子已经被作者于2002-12-281 41 11编辑过]
难道你只有一种T载体吗？3.6K OR 4.3K？想办法跑琼脂糖电泳把它们分分开，回收是必要的，否则你如何检测阳性克隆？
2种载体有抗性的区别？
如果你说4K加10K算大片段连接，那么也不至于太难做。
\"我的INSERT 和T载体得大小很接近,胶回收时候一不小心就会把T载体带进来一点,那就全完了.用过第2个酶切T载体以后再分离或者不分离灭活直接连接的做法,也没有成功.直接分离的话,因为不能用大上样量,所以得率不高.\"
chge,真不幸，又一次看到你的类似的帖子！不过这在分子生物学研究中常有的事情，我也遇到过。
我前一端时间构建了一个载体跟你的过程有点相同
我首先从人基因组DNA中PCR得到5Kb片段A，然后连接到TOP载体中，在用SalI从A-TOP载体中酶切得到A，将A连接到用XboI（与SalI同尾）酶切的载体（21kb）中，这个过程正常的话1-2个星期就可以完成，到我做了3个月后才经人指点连接成功。
我开始采用的方法是从A-TOP中用SalI酶切后，胶回收INSERT A，而21kb载体则酶切后热
变性（65C）后直接连接，做了近3个月一直不成功，当时郁闷之极
后来实验室的高手说胶回收时可能对酶切末端有损伤，他建议我采用选非INSERT中的酶酶切载体的方法处理A-TOP，21kb载体处理方法不变，结果阳性率为10-20%
之后我另外还构建了3个类似的载体，只是跟复杂一点，也是采用这种方法，很成功！
我看你也用过这种方法，但不知你为什么不成功
你的第2个载体是如何处理？
我想你可以首先要确保INSERT和载体的酶切完全，使用酶切载体方法时酶的选择一定是INSERT中不存在的
另外为何从T-VECTOR中得到的INSERT少呢，如果你加大INSERT-T-VECTORDNA的量不就能提高INSERT的量吗？
我这次的情况着实挠头，已经折腾我有半个月了，几乎各种常规的方式都做到了。
我是基因组PCR产物，原来以为直接可以克隆进入目的载体，所以也没有特别介意
PCR产物长度问题。后来，PCR产物直接连没成功（一共6个全都没有成功），所以改为
T载体（3923bp）可克隆的方式，前面几个都还可以，虽然有点曲折，但是都成了，两个目的载体一个是A =5826bp(vector)+2.7kb; B= 5.9kb+ 500bp+ 2.5kb; 现在要在A上加 C= 4.3kb(XhoI/XhoI),B上加 C= 3.6kb(SalI/SalI); 因为T载体和insert的长度很接近，开始用NarI orNaeI没切T载体，结果好像没切不好，得到的重组质粒都是原来的T载体连接产物。我用PCR 筛选。
第2轮采用直接分离的方法，跑胶达到6小时，总算分开了，其实还留了点，结果还是不行。
第3轮采用PvuI没切T载体，胶纯化，没有阳性克隆（有几个假阳性）；
然后采用1。SalI没切； 2. SalI/PvuI, 胶纯化； 3.. SalI/PvuI,直接灭活，然后连接，基本上还是失败。其中3 给出很多B的PCR阳性结果，然后用目的载体的PCR晒出2个，miniprep以后，没切鉴定发现是目的载体自连。
以上的各轮中假阳性结果中大多是T载体与insert的连接，要么是空的目的载体。 两个载体构件都在最后一步。
如果用单没切，例如SalI,胶回收时候，不能打上样量，所以得率不多。
如果用SalI/PvuI or XhoI/PvuI的话，还有可能。 目前正在大量积累载体和insert.
还有一个怪现象，我的insert实在T载体上的，细菌30%甘油-80冻存，直接用它长菌没有得到质粒，划盘后，挑克隆也没有，好在还有点质粒，直接转化后，跳克隆得到质粒了，但是用这个菌液直接再长，又没有质粒了，同时做的其他细菌扩增一点没有问题。
不知道是何原因，就这事，也耽误我好几天！
开始的时候，出现
难道你只有一种T载体吗？3.6K nbsp;OR nbsp;4.3K？想办法跑琼脂糖电泳把它们分分开，回收是必要的，否则你如何检测阳性克隆？
2种载体有抗性的区别？
如果你说4K加10K算大片段连接，那么也不至于太难做。
碰到问题难以解决或者身边没人，那么作为一个高素质的科研人员首先做的就是打破常规去尝试。我曾经看过一篇转化效率机制的文章。发给你参考？
i，你真是大救星啊，
一言提醒梦中人啊，我可以把insert再克隆到一个大小不一样的质粒中去是一试，就绝对不会有载体残留问题了。
回答你的问题： ２个载体抗性一样。amp的。
你说的公式可否发给我？我研究一下。 文章也可以发过来，如果方便的话。 chge@yahoo.com
多谢。
今天的结果是，用pvuI/XhoI酶切T载体+insert然后胶纯化作连接，设置了一个insert单独的对照，结果满盘都是！！
说明PvuI酶切不完全。
以外行身份参加讨论，希望各位别介意，我尚未做过一个克隆，下个月才做类似的反应，所以很感兴趣。个人理解：
连接反应是可以用以下公式表达的：
A+B=C
是双分子一级反应，且是平衡反应，平衡常数应小于1。欲提高c的产量，提高反应物A和B的浓度都可以，也可同时提高A和B的浓度来提高分子碰撞的机会进而提高产量。
有时我们有充足的A比如insert，或希望B能充分反应完，比如不希望有较多的空载体，则可以提高A的反应浓度，多少合适？设平衡常数为0.8（我假想的，没查），要使90%的B都参加反应，则用公式0.8=0.9/(0.1乘n)则n=11.25
有时我们有较好筛选C 的方法（搞性），则比例就不太重要而浓度重要。对于较小DNA的浓度在molecularcloning3上看到可用增稠剂：PEG处理。
今天的结果是，用pvuI/XhoI酶切T载体+insert然后胶纯化作连接，设置了一个insert单独的对照，结果满盘都是！！
说明PvuI酶切不完全。
我有个问题，为什么酶切载体时要等到转化后才能确定酶切是否完全，难道酶切后不能用琼脂糖电泳鉴定酶切是否完全吗？
还有一个问题，你选择酶切载体的酶，是在多克隆位点还是在以外的位置？最好是可以将载体部分拦腰砍断，至少要可以使酶切后的载体能与insert明显分开
i 的建议很有价值，可以试一试
很同意 i 的观点：作为一个高素质的科研人员首先做的就是打破常规去尝试
我做的就是如此。 其中一个为例，insert是3.6kb， T载体是3.9kb,在胶上稍微短一点是看不出来差别的。
我用得pvuI把T载体拦腰切断为大概1 和 2 kb左右（具体记不住了），还有NarI or NaeI都可以。
我用SalI/PvuI没切以后，为3个片段，最大的位我要的insert,但是如果其中含有微量的T载体的画，我是不可能知道的。
我的没切是20-40小时的，至少加了2次pvuI.
所以我现在目前面临的困境是：连接效果不好，可能是T载体+insert连接，也可能是连接物总量过小，都和insert纯化有关，或者合并有其他的原因。
所以i的话提醒我，我可以克隆insert到其他的与我目的insert大小差别比较大的载体里，然后在没切纯化，虽然耗时费力，但是也没有更好的办法了。
对了，谁知道那些载体比较小或者比较大？要一般性的，我对这些倒不是很清楚的。
作为打破常规，也不一定全对的，各有优缺点吧。每个人都有自己的观点，我上面说的两个人对连接比例的观点是截然相反的，两个人一个是日本博士，一个是美国博士，都用自己的方法成功地做出来过。
还有胶分离时的浓度，也有两种观点，一种说低浓度（0.6%), 一种说高浓度（甚至1.5%）.我实际使用的是高浓度1.2%。
3.6与3.9在0.8％左右的胶上勉强可以分开。为分开方便建议使用好胶如sigma，另加样时浓度调低一点，梳子用较窄的但可以用透明胶布搞宽点，胶做厚一点。这样跑出来条带容易分开并通过加样量的提高获得的片断数量。
你说你的T＋I质粒保菌后容易丢失，是不是你的片断比较特别，容易受到菌体的排斥。而在你的第二个载体里排斥更加厉害，以至于很难得到克隆。
谢谢dianhe的提醒，我会考虑这个问题。由i的建议引申开，我有了新的想法，既然我的问题（最起码是目前面临的问题）是insert从T载体上的纯化问题，我可以用NaeI切去T载体上1KB多片段（673- 1948）,其中f1 origin 和kan抗性基因丢失，没有破坏Amp基因，然后自连，做成一个小一点的质粒，那么，只剩下2.7k的T载体 和 3.6k or 4.3k的insert就可以容易分开了。应该如此，正在试。
还有一个方法，先PvuI酶切，胶纯化（此步必要），然后再用目的酶切，可以解决没切不完全的问题，这也是才想出来的方法，但是不如上面的容易得到大量insert。
我虽然没有用roche or sigma的agarose,应该质量没有太大的问题。我现在的问题不是分不开，而是如果要分开，上样量就不高；得不到大量的insert;如果用内切酶切T载体的话，又有可能切不完全，导致连接时候非特异连接增高（事实已经证明极高）。所以现在的面临的首要问题是排除干扰得到大量纯化的insert。
今天又遇到的问题是，用NaeI酶切过夜切，乱套了。上午重新买的酶，下午切了4小时，
仍然切不完全（对照XhoI已经切光了）。一查，NaeI对甲基化敏感。一方面加大酶量继续过夜（我的模板量不高，其实理论上有一个copy就够了）。另一方面用T+insert质粒从新用inv110感受态细胞制备质粒。
我的问题是：这种情况下，我加大酶量能否得到较好的酶切效果？因为用inv110细胞我还得多费2天时间。真是一个问题接着一个问题，都是意料不到的，感觉像是跑题了，唉！
我看你现在的关键问题不在于连接的浓度和比例,而是获得分离彻底的外源.
如果t vector的大小实在不合适,试一试自攒t/a载体.
平端酶(EcoR V) 切质粒(如 pBlueScript SK-) ,酚 氯仿纯化回收.
然后利用taq 将dttp加在平端上形成t tail,再酚 氯仿纯化回收.
详细如下,yog介绍的
1. Digest 1 μg of plasmid (such as pBlueScript SK-) with ablunt-end restriction enzyme (such as EcoR V) asfollows
1 μg of DNA in 40 μl of ddH2O
5 μl of 10X EcoRV Restriction Digest Buffer
0.5 μl of EcoRV Restriction Enzyme
Adjust the final volume to μl with ddH2O
Incubate at 37°C for 2 hours
2. Add 100 μl ofPhenol Chloroform Isoamyl Alcoholto the reaction mixture.
3. Centrifuge in a microcentrifuge at maximum speed for 10 min toseparate the phases.
4. Transfer the aqueous phase (upper phase) to a cleanmicrocentrifuge tube.
5. Add 100 μl of ice-cold 100% Ethanol and centrifuge in amicrocentrifuge at maximum speed for 10 min to pellet theDNA.
6. Discard the supernatant, invert the microcentrifuge tube overpaper towels, and allow the pellet to air dry.
7. Add 20 μl of 1X Taq Polymerase Buffer and mix until the pelletis completely dissolved.
8. Add 0.5 μl of 100 mM dTTP (final concentration 2 mM).
9. Add 1 Unit of Taq Polymerase per μg of DNA in the reaction, thenadjust to a final volume of 25 μl using ddH2O.
10. Incubate the reaction at 72°C for 2 hr.
11. Add 50 μl ofPhenol Chloroform Isoamyl Alcoholto the reaction mixture and mix well.
12. Centrifuge in a microcentrifuge at maximum speed for 10 min toseparate the phases.
13. Transfer the aqueous phase (upper phase) to a freshmicrocentrifuge tube.
14. Add 50 μl of Chloroform and mix well.
15. Centrifuge in a microcentrifuge at maximum speed for 10 min toseparate the phases.
16. Transfer the aqueous phase (upper phase) to a freshmicrocentrifuge tube.
17. Add 100 μl of ice-cold Ethanol and mix well.
18. Centrifuge in a microcentrifuge at maximum speed for 10 min topellet the DNA.
19. Discard the supernatant, add 100 μl of ice-cold 70% Ethanol,and mix well.
20. Centrifuge in a microcentrifuge at maximum speed to pellet theDNA.
21. Discard the supernatant and wash the DNA with 70% Ethanolagain.
22. Invert the microcentrifuge tubes over paper towels and allowthe DNA pellet to air dry for a couple of minutes.
23. Dissolve the DNA pellet in 1X TE.
24. For ligation reactions, use approximately 25 to 50 ng ofT-Vector
ROCHE的MS agarose可以分辨4个BP的差异片段，跑起电泳来和一般的不是一样吗，怎么会上样量少呢
to yog 因为两个片段相差不大，所以上样量必须降低浓度，用很长的样品槽，得到的回收，溶解在２５ul水中的浓度不超过２０ng/ul,
现在是过节，不说买东西要时间，就是用了也有可能还有问题。我上面讲了，能分开，但是有可能混有一点t载体的话，就麻烦了。
所以完全可能还有其他的原因导致连接转化失败，但是目前首先需要得到的是大量醇化的足够的insert.然后才能考虑别的因素，flame7799的方法，我想现在作的差不多吧，已经是等于在构件新的t载体了。如果成功的话，新的T载体大小为2.7kb,其中没有f1origin以及kan抗性基因。
这是一个胶分离例子,今天刚做的,还没有RUN完,中间监测. 1,2LANE是一种样品,3,4是另外一个样品.都是用NaeI切的.
显然,第3 LANE的样品比LANE 4 的要清晰的多. 但是这样的样品回收太低, 在其他的胶回收中存在就是这个同样的问题.MARKER是几十ng级别的.
这个不是我要分离的INSERT. 是重新构建T载体,用NaeI切,最高的两个片断大小相差1.3KB.
我上传的这个图片,分离我需要的东西,应该是足够的了,我只要1个拷贝就可以.
此主题相关图片如下：
我多数时候还是用笨方法，就这么切下来连，不管有没有混杂
最后多筛克隆， 基本上可以得到我想要的片段，你这样不行，只能怪你运气不好啦
我多数时候还是用笨方法，就这么切下来连，不管有没有混杂
最后多筛克隆， 基本上可以得到我想要的片段，你这样不行，只能怪你运气不好啦
我是多insert科隆，前面几个都是和你说的一样做的，有时候阳性克隆可达到60以上，又一次90%。现在是第3个片段插入，两个课题的两个载体都是同样现象，估计是有同样的问题。现在只有先得到大量纯化insert片段再说了。我的T载体已经测过序列，如果重新用其他的载体做的话，又要耽误1周时间了。
只能说运气不好。其实还不一定是现在怀疑的这个问题呢，那样的话，更糟糕。
你是什么意思啊？是整个T载体和PCR产物的连接么？
不是很好。我用得是invitrogen(就是原来的Gibco)的pCR2.1 TA克隆试剂盒，
蓝白筛选，兰斑效率低于50%。 不过总算还有阳性克隆。
我目前的T载体切除片段再连接还没有做完呢，不知道行不行，上帝保佑了。
我开始的时候是用PCR产物直接连接的啊，没有成功。6个，一个也不行。实在没有办法，才改用得TA克隆的方法的。
呵呵，这个图是今天分离NaeI没切T+insert得电泳，现在还有一个问题是NaeI对甲基化敏感，所以NaeI过量没切也不好，可能上面的结果要失败（上面的结果理论上只有两条带）。所以我昨天已经从新用质粒用inv110细胞转化非甲基化的质粒，今天各挑了3个菌落长去了，这样如果这个结果失败的话，用新质粒等于没有耽误时间（其实已经耽误不少了）。
连接的量的问题也是个问题，纯化量少，浓度低。如果要保持比例，一般最高90ng insert(4.3kb)， vector=? 9kb.如果不考虑比例，也高不了多少，我用Roche rapid kit or Takara kit 2,连接体系一般不超过10ul（takara）or 21ul(roche),所以总连接体积也不高10ul，连接产物全用上，一般挑30-40克隆，没有阳性或者假阳性。
每一次的没切纯化效果都不一样，如果多次纯化合并，又一次混入T载体，就全玩了。所以还是目前的法子可靠些。
chge，我看了你的电泳图，我觉得够亮了嘛，我以前回收过比你着还少的，一样可以连上。我用的是glassmilk回收，我觉得它回收效率很高。
我是个新手，还望大家多多执教；总的感觉，像这种大片段克隆是有一定难度。有两个问题：
（1）周围经验表明似乎对于10kb以上的连接产物用电转化效果最好；而宿主菌用DH10B或XL blue为佳
（2）如果纯化的片断浓度低的话，可以沉淀，但需要加glycogen（Invitrogen），这样可保证微量的DNA不至于因沉淀丢失掉。
学习chge大侠的精神！
呵呵，这个图是个样子，我只是想说明一下上样量和纯化效果的关系，不是真正要做的那个具体的克隆，是要作克隆的insert和T载体的重新质粒构建。
就上面的分离纯化后（中间的片断），溶解到25ul水里，然后取1ul作连接和转化，因为我要的就是自身连接，就是一般的对照吧，而且没有脱磷，怕菌落太多，所以没多用。结果每个盘上仅有几个菌落，都是如此。结果很奇怪的，不过估计可能和NaeI对甲基化敏感有关。但是第5 lane的结果是用sphI酶切的，结果也不多，倒是奇怪。死马当活马医吧。明天看看能不能长出来。
还有我遇到一件怪事，我同样的转化结果在Carb plate 上有，在Amp plate上就一个没有，同时铺盘。
有没有用过那个那个 是叫旋转蒸发仪吧， 我也记不清了
可以浓缩DNA的，那样的损失会很小的
chge
是呀,上次我路过陈家山也看见了旋转蒸发仪这个东西,效果不错,不如我介绍你也去定一台吧!
说实在的,其实抽真空干燥一下也行.
另外,我认为应该把得到阳性重组子的连接反应看成是两步反应,首先是外源和载体的一端连接,然后是重组的线性载体的两端自连形成环化的重组质粒.
连接体系里insert和vector的浓度有一个最佳值,既要保证第1步反应形成较多的重组型线性载体,又要保证第2步反应时,重组型线性载体的自连不受到未反应完的单体片断的干扰.也就是过高过低都不好.
一般,insert要高于vector,目的是让vector在第一步反应中尽量消耗光,不要形成自连空载体.但是,insert过高时也会干扰第二步incert-vector重组子的自连.这在小片断连接时不太明显.因为,小片断连接时,线性incert-vector重组子的自连比较容易.而当进行大片段连接时,这一步很难完成,就好比你拿着一个1米长的勺子吃饭,困难极了.
insert和vector的比例实际上并不是很重要,一般情况下,我们用的外源和载体长度不会相差十倍,3 1就可以满足大多数的要求.要注意到实际上是小片断连接时外源加的一般比较多.
给一个极限的例子;建BAC库时,外源200Kb,载体7.5Kb,通常连接时外源 载体为1 10,注意,这时是载体绝对过量.
连接是很痛苦的,但也很值得我们去思考.还有一些想法不成熟,以后再谈吧!
yog
我没建过bac库,国内建bac库的人可能加起来也不到十个.不过,国外的protocol上大多数都是这个比例.我认为你说的也有道理.估计这个比例也是来自理论和实践的停战协议书.
本文链接： http://pbl.immuno-online.com/view-1123514225.html
发布于 ： 2024-05-15
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